斑馬魚呼吸代謝及行為分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

斑馬魚作為一種模式動物，與人類共享高達(dá) 70% 的基因組，保留了多達(dá) 80% 的人類疾病相關(guān)蛋白。同樣作為一種脊椎動物，斑馬魚與人類的組織和發(fā)育生物學(xué)過程相似，故而針對各種癌癥、肝病、血液疾病、心臟病和行為障礙的斑馬魚模型被建立起來，斑馬魚進(jìn)而成為了基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)病機(jī)理、藥物篩選領(lǐng)域的主要模式動物，在生物醫(yī)學(xué)研究的地位越來越重要(Patton et al., 2021)。

北京易科泰提供生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域斑馬魚呼吸代謝及行為分析的全套技術(shù)方案，包括斑馬魚成魚和魚卵、胚胎、幼魚的呼吸代謝測量、斑馬魚視頻跟蹤和行為分析及游泳能力評估。具體測量參數(shù)及應(yīng)用方向如下：

模塊1.成魚呼吸代謝測量

斑馬魚幼魚及成魚呼吸代謝測量系統(tǒng)采用了經(jīng)典的間歇式(Intermittent flow/stop-flow)測量法，兼具高時(shí)間分辨率和長期監(jiān)測的特點(diǎn)。針對斑馬魚體長短、體重輕、耗氧量低等特點(diǎn)，采用了小型的呼吸室、水泵及非接觸式的光學(xué)氧氣傳感器，確保獲得可靠的耗氧曲線和耗氧率數(shù)據(jù)。系統(tǒng)具備自動控制、測量和分析的功能，放入斑馬魚樣品、設(shè)置間歇測量各階段的時(shí)間后，系統(tǒng)即可自動運(yùn)行和計(jì)算耗氧率，研究人員也可借助配套軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)代謝率(SMR)等數(shù)據(jù)。

易科泰公司提供同時(shí)自主集成的斑馬魚呼吸測量系統(tǒng)，可自動切換小型水泵的開閉狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了自動化間歇式測量。溶解氧監(jiān)測采用了熒光光纖氧氣傳感器，具備高靈敏度和高分辨率，并且易安裝、零維護(hù)。

模塊2. 魚卵、胚胎、幼魚高通量呼吸代謝測量

斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測量由內(nèi)置氧氣感應(yīng)貼片的24孔板、氧氣測量主機(jī)、密封配件等組成，多個(gè)氧氣測量主機(jī)可串聯(lián)組成最多240個(gè)通道的高通量測量系統(tǒng)。

應(yīng)用案例

因與哺乳動物具有功能相似的肝臟細(xì)胞和與人類相似的脂質(zhì)代謝，斑馬魚是研究肝病的有效模型。南卡羅萊納醫(yī)科大學(xué)的研究人員在KDSR（3-酮-二氫鞘氨醇還原酶）突變體斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了肝病表型過程，并對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)KDSR缺失導(dǎo)致鞘脂補(bǔ)救途徑的代償性激活和磷酸鞘氨醇(S1P)的積累，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體活性增加、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及隨之而來的肝細(xì)胞損傷。因此KDSR可能是一種新的脂肪變性和肝損傷的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子(Park et al., 2019)。

該研究中的耗氧實(shí)驗(yàn)便采用了斑馬魚魚卵、胚胎、幼魚呼吸代謝測量系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了幼魚耗氧率的高通量、快速測定。先在24孔板的每個(gè)孔加入125μL的卵水，在24℃下運(yùn)行20min，之后放入3條幼魚，立即使用封口膜密封和硅膠墊壓實(shí)。使用配套軟件記錄，每3min記錄一次溶解氧濃度，持續(xù)30min。根據(jù)溶解氧濃度隨時(shí)間的變化計(jì)算了耗氧率，下圖展示了對照組和突變體各3條幼魚的7次測量結(jié)果。發(fā)現(xiàn)相比于對照組斑馬魚，KDSR突變體的耗氧率有所升高，該結(jié)果支持KDSR突變體線粒體β-氧化增強(qiáng)的結(jié)論。

模塊3. 高通量視頻跟蹤及行為分析

斑馬魚視頻跟蹤和行為分析系統(tǒng)由高清高幀頻工業(yè)相機(jī)、斑馬魚行為分析軟件、斑馬魚活動室/池等組成。先錄制高質(zhì)量斑馬魚活動視頻，再在計(jì)算機(jī)上使用專業(yè)行為分析軟件對視頻中的斑馬魚進(jìn)行分析，獲得其隨時(shí)間變化的行為軌跡（X坐標(biāo)和Y坐標(biāo)；單條斑馬魚可做3D跟蹤，包括X、Y、Z坐標(biāo)），最后自動計(jì)算獲得數(shù)十種行為學(xué)參數(shù)。基于機(jī)器視覺的斑馬魚行為分析系統(tǒng)，能夠?qū)?/span>24孔、48孔、96孔板中的斑馬魚進(jìn)行高通量行為采集和分析，使研究者輕松獲得大量行為數(shù)據(jù)。

應(yīng)用案例

    肌側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS) 是最常見的緩慢進(jìn)展性運(yùn)動神經(jīng)元疾病，以肢體和延髓上、下運(yùn)動神經(jīng)元損害并存為特征，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性四肢骨骼肌無力、肌束震顫，并伴有肌張力增高、腱反射亢進(jìn)、病理征陽性，最終呼吸衰竭死亡，患者平均生存期為3～5年。

    大部分ALS病例為散發(fā)型，但仍有約10%的病例為遺傳型，由不同基因突變引起。超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突變是主要致病基因，約占遺傳型病例的20%。SOD1在大部分組織中廣泛表達(dá)，主要參與自由基清除。盡管SOD1相關(guān)的ALS發(fā)病機(jī)制已有報(bào)道，但SOD1突變誘導(dǎo)的病理學(xué)機(jī)制尚不得而知。為此，高麗大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員構(gòu)建了能夠在成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)攜帶G93A突變的人SOD1的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，并考察了其病理特征和對運(yùn)動神經(jīng)元的影響(Kim et al., 2019)。

該研究中的行為分析使用了斑馬魚視頻跟蹤和行為分析系統(tǒng)：將成年斑馬魚逐條轉(zhuǎn)移至1L的水箱中，令其適應(yīng)30min后，使用攝像機(jī)從側(cè)面記錄斑馬魚的游泳行為，獲得了平均游泳速度、非活動時(shí)間（休息時(shí)間）、在水箱底部花費(fèi)的時(shí)間等參數(shù)，并對感興趣的行為（包括靜止、異?；顒?、趨觸性和運(yùn)動缺陷）的時(shí)間進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

發(fā)現(xiàn)在8個(gè)月之前，SOD1突變斑馬魚和野生型斑馬魚的游泳速度無明顯差異；在早期癥狀階段（8個(gè)月-11個(gè)月），SOD1突變體斑馬魚的平均游泳速度有所增加；直到疾病晚期SOD1突變斑馬魚游泳速度降低。且在早期癥狀階段，大部分SOD1突變斑馬魚表現(xiàn)出焦慮樣行為失常，包括趨觸性、靜止和異常活動以及輕微的運(yùn)動缺陷。除此之外，在14個(gè)月大的時(shí)候，SOD1突變斑馬魚休息的時(shí)間占比更大，表明其運(yùn)動活性降低。

模塊4. 游泳能力

        l 斑馬魚游泳能力研究測試系統(tǒng)為一站式方案，包括斑馬魚專用小型游泳室和自動化水流速度控制、校準(zhǔn)的所有軟硬件。系統(tǒng)提供適合斑馬魚游泳匹配的高精度控制水流，水流調(diào)節(jié)速度為0.7 - 50 cm/s。

該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)水流速度的校準(zhǔn)、轉(zhuǎn)換、校正和控制，單位和方式任選（如以BL/sec為單位的游泳速度），可對Solid Blocking效應(yīng)（斑馬魚自身阻礙水流引起的水流速度變化）進(jìn)行校正，并且能夠創(chuàng)建自動化的用戶自定義程序。

應(yīng)用案例

心肌病是指心肌在缺血、高血壓等外在壓力和基因突變等內(nèi)在壓力的作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致心力衰竭的心臟疾病。心肌病包括肥厚性心肌病(HCM)、擴(kuò)張性心肌病(DCM)和限制性心肌病(RCM)等類型。30%~50%的DCM患者有基因突變和家族遺傳背景；80%~90%為常染色體顯性遺傳。高效、高通量的動物模型對于評估相關(guān)候選基因、加快新基因發(fā)現(xiàn)過程具有重要作用。

美國梅奧醫(yī)學(xué)醫(yī)院的研究人員利用基因組編輯技術(shù)得到了已知心肌病基因Gatad1被敲除的斑馬魚(Yang et al., 2016)。在游泳能力測試環(huán)節(jié)，為增加成年斑馬魚對心力衰竭的易感性，對野生型和突變斑馬魚同時(shí)進(jìn)行高膽固醇飲食和乙醇處理。饑餓24小時(shí)后，將斑馬魚放入游泳室。以9 cm/s（200rpm）的速度適應(yīng)20min后，水流速度以8.66 cm/s (100 rpm) (Ui)的增量遞增，每個(gè)速度梯度持續(xù)2.5min（Tii）。當(dāng)斑馬魚力竭，無法從下游恢復(fù)游泳時(shí)，記錄最大游泳速度（Uii）和測試的總時(shí)間（Ti）。之后使其恢復(fù)30min，測量體長BL。臨界游泳速度根據(jù)以下公式計(jì)算：

上述測量結(jié)果顯示突變體的游泳能力相比于同齡野生型顯著降低，并且突變斑馬魚在大約7個(gè)月大時(shí)開始死亡，與同齡野生型對照魚相比，其存活率顯著下降。該結(jié)果支持GATAD1是DCM誘發(fā)基因的結(jié)論。

模塊5. 身體適應(yīng)力（physical fitness）評價(jià)

    斑馬魚身體適應(yīng)力（physical fitness）評價(jià)系統(tǒng)將游泳能力研究測試功能和呼吸代謝測量功能相結(jié)合，通過測定游泳速度-耗氧率的變化曲線評估斑馬的體力和身體適應(yīng)性。

應(yīng)用案例

鋅是人體必需的微量營養(yǎng)成分，在酶活性、免疫功能、神經(jīng)功能和繁殖等生物過程中起到重要作用。孕婦缺鋅是一個(gè)公共衛(wèi)生問題：據(jù)估計(jì)高達(dá)82%的孕婦鋅攝入量不足。缺鋅既與早產(chǎn)、低出生體重和先天性畸形的增加有關(guān)，也與后代葡萄糖耐受性受損、糖尿病易感性增加以及學(xué)習(xí)和記憶受損有關(guān)。

和人類一樣，斑馬魚也需要攝入鋅，并且有類似的調(diào)節(jié)機(jī)制來維持鋅的動態(tài)平衡。因此，美國俄勒岡州立大學(xué)的研究人員專門為斑馬魚開發(fā)了一種缺鋅飼料，用其飼養(yǎng)成年斑馬魚導(dǎo)致其缺鋅。研究結(jié)果表明親代缺鋅會使其后代也缺鋅，并對后代產(chǎn)生死亡率顯著增加、體力活動減少等不利影響。缺鋅斑馬魚胚胎中調(diào)節(jié)金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基因（包括鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體、金屬調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子）表達(dá)發(fā)生了變化，與糖尿病和胰腺發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)有所下降。缺鋅子代的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下降，意味著親代缺鋅可能導(dǎo)致其子代的表觀遺傳圖譜發(fā)生改變。該研究提供了數(shù)據(jù)支持，證明了缺鋅孕婦補(bǔ)充鋅是有益(Beaver et al., 2017)。

該研究測量了不同水流速度下的成年斑馬魚氧氣消耗率，以評估其身體適應(yīng)力：以8條成年斑馬魚為一組，放入2.5L的游泳儀，每10min測量一次。采用間歇式的測量方式，具體時(shí)間設(shè)置為60s等待、240s沖洗、300s測量。先使斑馬魚適應(yīng)30min，隨后的30min使其在5cm/s（108rpm）的水流速度下自由游動，接著分別將水流速度設(shè)置成25 cm/s（504 rpm）和45cm/s（901 rpm），最后恢復(fù)至5cm/s（108rpm）的水流速度。每個(gè)流速梯度持續(xù)30min。取線性相關(guān)性高于0.8的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行分析。

如下圖，在適應(yīng)階段，對照組和缺鋅斑馬魚的耗氧率沒有差異。隨著水流速度的提升，缺鋅斑馬魚游動更劇烈，導(dǎo)致其耗氧率顯著升高。重要的是斑馬魚表現(xiàn)出顯著的飲食效應(yīng)，即缺鋅斑馬魚比對照組消耗更多的氧氣——在最高水流速度（901rpm）時(shí)缺鋅斑馬魚要多消耗28%的氧氣。因此，缺鋅導(dǎo)致斑馬魚身體適應(yīng)度（physical fitness）降低。

參考論文

1.Beaver, L.M., Nkrumah-Elie, Y.M., Truong, L., Barton, C.L., Knecht, A.L., Gonnerman, G.D., Wong, C.P., Tanguay, R.L., and Ho, E. (2017). Adverse effects of parental zinc deficiency on metal homeostasis and embryonic development in a zebrafish model. The Journal of Nutritional Biochemistry 43, 78–87. 

2.Kim, S., Chung, A., Na, J.E., Lee, S.J., Jeong, S.H., Kim, E., Sun, W., Rhyu, I.J., and Park, H. (2019). Myelin degeneration induced by mutant superoxide dismutase 1 accumulation promotes amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 23669. 

3.Park, K.-H., Ye, Z., Zhang, J., Hammad, S.M., Townsend, D.M., Rockey, D.C., and Kim, S.-H. (2019). 3-ketodihydrosphingosine reductase mutation induces steatosis and hepatic injury in zebrafish. Sci Rep 9, 1138. 

4.Patton, E.E., Zon, L.I., and Langenau, D.M. (2021). Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov 20, 611–628. 

5.Yang, J., Shah, S., Olson, T., and Xu, X. (2016). Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. JCDD 3, 6.